5. Laboratorieprosedyrer

Kapittelansvarlige: Anna Wittersø (hovedansvarlig), Ranja Christiansen, Kristiane Søreng, Livmorhalsprogrammet

5.1 Innledning
5.2 Laboratorieprosedyrer
5.3 Prøvemottak
5.4 HPV-analyser
5.5 Kvalitetskontroll
5.6 HPV analyse-plattform
5.7 Cytologi
5.8 Arkivering av prøver og biobanking
5.9 Tilbakemelding til prøvetakere
5.10 Referanser 

5.1 Innledning

Når prøven mottas i laboratoriet, skal den være gjenstand for optimal teknisk bearbeidelse og undersøkelse, samt sikres mot forveksling med andre prøver¹. Etter utført vurdering skal svarene rapporteres til rekvirent og sendes elektronisk til Livmorhalsprogrammet hver virkedag. Se www.kreftregisteret.no/Registrene/Innrapportering/Rapportering-av-patologiinformasjon/ for spesifikasjoner.

5.2 Laboratorieprosedyrer

Laboratoriet skal ha prosedyrer som gir detaljert beskrivelse av avdelingens virksomhet. Prosedyrene skal finnes lett tilgjengelig i en elektronisk prosedyrehåndbok, og hver ansatt skal dokumentere at relevante prosedyrer er lest ved opplæring.
Prosedyrene skal gi en detaljert beskrivelse av mottak av livmorhalsprøver, prioritering av prøver, registrering av rekvirent- og pasientdata i laboratoriets dataprogram, preparering, farging, cytologisk screening og vurdering, HPV-analyse, intern og ekstern kvalitetskontroll, avviksregistrering, opplæring og vedlikehold av teknisk utstyr.

5.3 Prøvemottak

5.3.2 Utvelgelse av prøver til screening

Det er nødvendig å ha et datasystem som er programmert slik at livmorhalsprøvene blir sortert i riktig kategori: screening (primær HPV test), oppfølging eller livmorhalsprøve pga symptomer/funn. Videre skal datasystemet programmeres med en algoritme som ved hjelp av fødselsdato, historikk og kjønn sorterer kvinnen til riktig kategori. Dersom det ikke er mulig å programmere inn algoritme for kliniske opplysninger i LIS, skal det utføres en manuell kontroll for kliniske opplysninger for prøver til HPV test, for å kontrollere om det også skal lages et cytologisk preparat.

Det er utarbeidet P-koder som skal benyttes for kategorisering av prøvene (tabell 5.1). Definisjonen på en screeningprøve i henhold til «Flytskjema for vurdering av livmorhalsprøver» er at der ikke har vært noen unormale prøver siste tre år (se figur 1)¹, dvs. ingen positiv cytologi, HPV eller relevant histologi. For kvinner med uavklarte tidligere prøver må det gjøres en individuell vurdering.

Tabell 5.1: P-koder til bruk for kategorisering av livmorhalsprøver

5.3.3 Utvelgelse av prøver til oppfølging eller utredning pga symptom/funn

Dersom kvinnen har funn på forrige prøve eller prøven er tatt pga symptomer, er prøven ikke en screeningprøve. Oppfølgingen for tidligere lavgradige celleforandringer eller HPV positiv prøve, er HPV-test (Se Nasjonale retningslinjer). Råd for oppfølging av uavklarte høygradige celleforandringer og/eller persisterende HPV positive og koniserte kvinner siste 10 år finnes i «Veileder for gynekologisk onkologi».

Viktig: Listen er ment som veiledende, men der kan også dukke opp andre relevante symptom som kan være aktuelle for cotesting

NB: Ved følgende relevante kliniske symptom/funn bør prøven vurderes med både cytologi og HPV-test.

• postmenopausale blødninger
• postcoitale blødninger
• intermenstruell blødning uten annen forklaring
• blødning under graviditet
• blodig utflod
• annen klinisk mistanke om cervix dysplasi eller cancer:
  • underlivssmerter uten annen forklaring
  • erosjon/erytroplaki
  • mosaikk/ punktasjoner
  • leukoplaki

Kvinner under 25 år:

Livmorhalsprogrammet starter fra 25 års alder. Cytologiske prøver av kvinner under 25 år skal kun følges med cytologi, ikke HPV test, også ved symptomer. Oppfølging av tidligere lavgradige celleforandringer skal kun følges med cytologi. Ved uegnet cytologi ber man om ny prøve om 1-3 måneder. Uegnet cytologi skal ikke HPV testes.

Råd for oppfølging av høygradige celleforandringer, uavklarte høygradige celleforandringer og/eller persisterende HPV positive og koniserte kvinner siste 10 år finnes i Nasjonalt Handlingsprogram for Gynekologisk Kreft.

Kvinner over 69 år:

Kvinner som er eldre enn 69 år, skal testes primært for HPV, dersom ikke annet er spesifisert på rekvisisjonen. Oppfølging avgjøres av rekvirent, da prøven ikke er en screeningprøve.

5.3.4 Avvisning av screeningprøver eller kontrollprøver

Patologiavdelingen kan etter faglig vurdering avvise en ny screening/kontrollprøve dersom det er analysert en prøve for mindre enn 6 måneder siden. Prøven skal ikke avvises om rekvirent gir kliniske opplysninger om symptomer eller andre kliniske opplysninger som tilsier at prøven skal analyseres, eller dersom prøven er en oppfølgingsprøve etter en positiv HPV hjemmetest.

5.4 HPV-analyser

Det settes krav til plattform for utførelse av HPV-analyse for HPV primærscreening og HPV sekundærscreening, som er beskrevet under punkt 5.6 «HPV-analyse plattform»». Det er anbefalt at laboratoriene akkrediteres for HPV-analyse for å sikre et godt kvalitetskontrollsystem².

Prøver til HPV-analyse behandles som smittebærende materiale, og prøvematerialet og laboratorieområdet (inkludert maskiner og utstyr som inngår i HPV-plattformen) skal håndteres i henhold til retningslinjer gitt i «Human papillomavirus laboratory manual»³ og «Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories»⁴ og etter generelle prosedyrer for god laboratoriepraksis.

Før HPV-analyse skal HPV-prøvene håndteres i henhold til leverandørens anbefalinger hva angår lagringstemperatur, holdbarhet av prøvematerialet, eventuelle forbehandlinger av prøvematerialet og andre analysemessige hensyn som må etterleves. Det skal føres oversikt over LOT-nummer på kit og kontrollresultater (ct-verdier fra PCR) slik at det er mulig å spore tilbake dersom det er behov for feilsøking og slik at man til enhver tid har kontroll på eventuelle endringer i analyseprestasjon. Lotskifte bør verifiseres.

5.4.1 Vurdering av prøve før og etter HPV-analyse

5.4.1.1 Blodige prøver

Livmorhalsprøver har ofte visuelt detekterbare nivåer av fullblod med rosa eller lysebrun farge. Slike prøver behandles på HPV-plattformen på normal måte. Det er kjent at prøver som er sterkt blodtilblandet, kan hemme PCR amplifikasjonen og gi negativ internkontroll eller falske negative resultat i PCR. Prøver som inneholder over 2 % fullblod i ThinPrep-medie, 10% fullblod i Thinprepmedie eller 4 % fullblod i SurePath-medie (ifølge pakningsvedlegg for henholdsvis Cobas 4800, Cobas 6800 og BD Onclarity HPV), bør derfor håndteres med dette i bakhodet, og et negativt HPV-svar fra slike prøver bør besvares med en kommentar om dette. Forslag til resultat-tekst: Høyrisiko HPV er ikke påvist i prøven, men pga. sterkt blodtilblandet prøve, kan et falskt negativt svar ikke utelukkes. Det anbefales ny HPV-test innen 1-3 mnd.

Ved HPV-testing av eddiksyrebehandlet materiale er laboratoriene forpliktet til å sette seg inn i hvilke retningslinjer som gjelder for deres aktuelle HPV-plattform, og hva som er validert i forhold til dette. De ulike HPV-plattformene kan være validert for ulike typer eddiksyrebehandling, og det er også en mulighet for at de ulike laboratorier må gjøre en validering for dette selv dersom det er behov for å gjøre HPV-analyse på eddiksyrebehandlet materiale.

5.4.1.2 Interferens i HPV-prøven

Det kan forekomme «inkonklusivt» resultat pga lite celler i prøven, mye betennelsesceller, bruk av soppdrepende midler vaginalt eller bruk av vaginalkrem under prøvetaking som inhiberer PCR og deteksjon av betaglobin. Slike prøver skal re-analyseres. Dersom re-analysen fortsatt er «inkonklusive» bør det bes om ny prøve fra kvinnen i henhold til «Flytskjema for vurdering av livmorhalsprøver», figur 1. Det kan oppstå konkurranse i PCR som vil gi «inkonklusivt» resultat på en kanal i PCR-deteksjonen, mens andre kanaler er positive. I henhold til ny screeningsalgoritme fra 2024 er det av betydning om kvinnen er positiv for HPV 16/18 eller HR HPV. Dersom prøven er HR HPV positiv, negativ for HPV 16 (eller 18) og inkonklusiv for HPV 18 (eller 16) skal prøven analyseres på nytt. Dersom samme resultat fremkommer, bør prøven utredes med genotypingsanalyse slik at kvinnen følges opp i rett løp av screeningsalgoritme.

Det kan forekomme at hele oppsettet blir inkonlusivt, og dette kan forekomme dersom betaglobin og/eller en/flere av de positive kontrollene ikke kommer opp. Avviket bør meldes i foretakets avviksmeldesystem. Det bør meldes leverandør dersom oppsettet blir inkonklusivt pga de positive kontrollene ikke blir godkjent.

5.5 Kvalitetskontroll

Det er viktig med systematisk kvalitetssikring av HPV-analysene for å sikre pålitelige resultater^{5, 6}.

5.5.1 Interne kontroller

Kit-avhengige kontroller inngår i reagensene og brukes ved hvert analyseoppsett. For å kunne føre kvalitetskontroll ved analyseprosessen overvåkes CT-verdiene for kontrollene ved hver kjøring, og noteres i elektronisk kontrollskjema.

Kit-uavhengige kontroller har som hensikt å overvåke presisjon, samt oppdage endringer i sensitivitet og trender. Disse kontrollene skal inkluderes minimum en gang i måneden og ved åpning av nytt reagenskit. Det anbefales kit-uavhengig kontroll for alle kanaler i analysen slik at uregelmessighet knyttet til alle forhold kan oppdages. Cellelinjer, anonymiserte pasientprøver eller plasmider (human bakgrunn) egner seg for dette formålet, fortynnet i samme medium som brukes for pasientmateriale. Ved spørsmål kan HPV-referanselaboratoriet kontaktes. Ct-verdiene noteres i et elektronisk kontrollskjema.

5.5.2 Eksterne kontroller

Det er et krav at alle laboratorier som utfører HPV-analyse deltar i minimum årlige kvalitetsprogrammer som dekker hhv SurePath og/eller ThinPrep. Det finnes ulike eksterne kvalitetsprogrammer tilgjengelig (QCMD, Instand etc) som ethvert laboratorium har ansvar for å melde seg på. Equalis-screeningspanel ble i 2022 tilgjengelig gjennom Karolinska (Global HPV DNA screening proficiency panel 597) og distribuert gratis via Referanselaboratoriet ved Ahus. Hvorvidt dette videreføres til 2025 er foreløpig usikkert. Referanselaboratoriet informerer laboratoriene så snart mer informasjon om dette foreligger.

5.6 HPV analyse-plattform

HPV-tester for bruk i screeningprogrammet blir vurdert to ganger i året av en faggruppe nedsatt av Helsedirektoratet, etter søknad fra leverandør. Faggruppen foretar da en vurdering av om HPV-testen tilfredsstiller de faglige kravene. En liste over krav til HPV-tester som skal brukes i HPV-primærscreening, samt hvilke HPV-tester som oppfyller kravene kan finnes på lenken under.

https://www.kreftregisteret.no/screening/livmorhalsprogrammet/Helsepersonell/HPV-i-primarscreening/krav-til-hpv-tester-som-kan-brukes-i-primarscreening/

5.7 Cytologi

For kvalitetssikring av cytologi se kapittel 6

5.7.1 Preparering og farging

Preparering
Væskebasert cytologi (VBC): Cellemateriale i fikseringsvæske fra prøvebeholder prepareres over på et objektglass i cytologilaboratoriet med et metodespesifikt instrument. Restmaterialet i væsken kan bl.a. brukes til HPV-testing.

Vasking
Svært blodige Thinprep prøver bør «vaskes» (hemolyseres) før tillaging av preparat. De prøvene som ikke plukkes ut av laboratoriet kan i etterkant plukkes ut ved screening. Blodige Thinprep-prøver med for lite plateepitelceller blir i de fleste tilfeller (ca. 80 %) egnet etter «vasking» og laging av nytt preparat.

Det kan vurderes å lages nytt preparat dersom preparatene er forurenset av andre årsaker enn blod, som f.eks ved betennelseceller eller slim.

Farging
Preparatene farges med Papanicolaous fargemetode eller tilsvarende før vurdering i mikroskop. Det finnes flere ferdigblandete fargeløsningssett av ulike fabrikat. Fargestoffene og pH på fargeløsningene er som regel ikke standardiserte fra fabrikanten. Laboratoriet bør uansett kontrollere fargingen daglig etter første fargestativ, og om nødvendig, justere fargeprosedyren.

Det cytologiske preparatet skal ha godt farget kromatin, differensiert cytoplasmafarge og transparent cytoplasma. Det er optimal kjernefarge når fargen er mørk nok til å se kromatinstrukturen i kjernene i de intermediære plateepitelcellene og lys nok til å se det samme i godt bevarte granulocytter.

5.7.2 Teknisk utstyr – mikroskop

Det skal benyttes binokulært lysmikroskop med objektiv på 2,5 eller 4x (for oversikt), 10x (for screening) og 40x (for detaljer). I preparat med mange umodne celler, som ved atrofi og post-partum, anbefales det å screene med 20x objektiv.

5.8 Arkivering av prøver og biobanking

Arkivering av cytologiske prøver omfattes av «Lov om behandlingsbiobanker».

Arkivering
Rekvisisjon: Papir bør lagres i minimum tre måneder eller varig i elektronisk dokument.

Svarrapport: Papir eller elektronisk svar bør lagres i minimum 10 år. Varig lagring er tilrådd.  

Inn- og utlån fra arkiv skal registreres.

Cytologiske preparat: Alle cytologiske preparat må lagres i minimum 10 år på forsvarlig måte mht. pasientbehandling og mulighet for kvalitetskontroll og undervisning. Varig lagring er tilrådd, men er ikke påkrevd i behandlingsbiobankloven.

Biobanking av overskuddsmateriale etter HPV-analyse
Ved innføring av HPV-primærscreening vil det ikke være krav om biobanking av cellemateriale etter HPV-analyse. Dette ble besluttet av styringsgruppen for Livmorhalsprogrammet 30.april 2018.

5.9 Tilbakemelding til prøvetakere

Prøvetakere som har mange uegnede prøver må gjøres oppmerksomme på dette og få råd om forbedringstiltak. Kreftregisteret kan på oppfordring sende liste over laboratoriets rekvirenter og andel uegnede prøver.

5.10 Referanser

1. Flytskjema for vurdering av væskebaserte livmorhalsprøver 2018 [Available from: https://www.kreftregisteret.no/screening/livmorhalsprogrammet/Helsepersonell/ny-algoritme-fra-1.7.2018/.
2. NA Dok. 25/31(Norsk Akkreditering), kravdokument for akkrediterte laboratorium
3. Human papillomavirus laboratory manual 2009 [Available from: https://www.who.int/publications/i/item/WHO-IVB-10.12
4. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories [Available from: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 6th Edition | CDC Laboratories
5. European guidelines for quality assurance in cervical cancer screening. 2 ed, 2008.
6. Kvalitetssikring i cervixscreening, 2011.
7. NOU 2001:19. Biobanker. Innhenting, oppbevaring, bruk og destruksjon av humant biologisk materiale

Tilbake til Kvalitetsmanualen